Summary & Methods
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Molecular glue compound → protein-protein interaction을 유도하거나 안정화하는 compound.
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이 때, 어떤 단백질과 Ubiquitin ligase의 interaction을 유도하는 물질은 결국 해당 단백질의 분해를 유도한다고 볼 수 있음.
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이러한 compound를 molecular glue degrader라고 함.
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PRISM repurposing과 CCLE gene expression 정보 써서 candidate drug CR8 선정.
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Whole-proteome quantification을 통해서 CR8 처리시 Cyclin K 단백질 수준이 감소함을 확인.
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Genome-scale CRISPR screening을 통해서 CR8 resistance 에 관여하는 유전자, 혹은 Cyclin K degradation에 관여하는 유전자를 탐색함.
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나머지는 구조분석
Results
← DDB1 (CUL4A adaptor protein; E3 ubiquitin ligase의 component) 발현량이 증가할수록 CR8 toxicity가 증가하더라. → 뭔가 CR8의 작용 기작이 E3 ubiquitin ligase와 연관되어 있을 것 같다.
PRISM repurposing dataset에서 확인한 결과.
← DDB1을 CRISPR-mediated inactivation 시키면 CR8의 toxicity가 사라지더라.
즉, CR8의 toxicity에는 DDB1이 필요하다.
← CR8 처리 시 Cyclin K의 단백질 양이 감소하더라.
CR8이 Cyclin K를 E3 ubiquitin ligase-dependent 하게 분해하는 건가?
Tandem mass tag mass spectrometry 로 whole proteome quantification 수행함.
← MLN~ 들은 E3 ubiquitin ligase 혹은 단백질을 분해하는 proteasome의 작용을 억제하는 compound라고 보면 됨.
이런 compound 처리 시에 CR8이 Cyclin K를 분해하지 못하는 걸 보면 CR8의 Cyclin K 분해에는 E3 ubiquitin ligase의 작용과 proteasomal degradation이 필요하다는 걸 알 수 있음.
← Genome-scale CRISPR screening으로 어떤 유전자들을 inactivation 시켰을 때 CR8 저항성이 나타나는지 확인함.
cullin-RING E3 ubiquitin ligase의 활성화에 필요한 유전자들이 매우 상위에 잡힘.
→ genetic evidence
← 같은 방식으로 genome-scale CRISPR screening을 수행하여 CR8-induced cyclin K degradation 에 필요한 유전자가 무엇인지 확인함.
DDB1과 CDK12에 주목함.
DDB1은 E3 ubiquitin ligase의 component.
CDK12는 원래 알려진 CR8의 target. (CR8은 원래 CDK inhibitor로 사용되던 약물)
→ CDK12와 CR8의 결합이 Cyclin K의 분해에 꼭 필요하다는 것인가?
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아래는 이를 보이는 분석들
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a) Co-IP 분석. DDB1과 CDK12-cyclin K의 결합에 CR8이 필요하다는 걸 알 수 있고, BPB domain이 없어도 DDB1이 CDK12-cyclin K와 결합 가능함을 알 수 있음.
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b) 각 상황에서 Cyclin K ubiquitination을 western blot으로 직접 확인함. CUL4-RBX1-DDB1 ligase core만 있어도 ubiquitination이 된다.
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c) CR8 처리시 CDK12-cyclin K와 DDB1의 interaction이 강해지는 것을 FRET으로 확인.
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d) Crystallization으로 DDB1 - CR8 - CDK12 - Cyclin K complex 구조 확인.
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e) CDK12 kinase domain (713-1052?1032?) 에 mutation 준 경우는 WT CDK12-cyclin K-DDB1-CR8 보다 interaction 약하다. → Kinase domain이 interaction에 중요
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Fig 3
